铁死亡的发生机制及在脓毒症多器官功能障碍中的作用

脓毒症是机体对感染诱发的免疫反应失调引起的多器官功能障碍综合征，住院病死率可达20%，严重危害人类健康，目前尚无有效的治疗手段^[1]。对于脓毒症的发病机制研究主要集中在器官微循环障碍、异常免疫反应导致细胞线粒体功能障碍及诱导细胞死亡等方面^[2,3]，但脓毒症发病的确切机制尚无定论。近年来越来越多研究关注到微量元素代谢失调在脓毒症发病中的作用^[4]。铁死亡是在2012年由Dixon等^[5]首次提出，本质是一种细胞内铁过载触发脂质过氧化所引起的一种程序性细胞死亡，在形态学、生化和遗传学方面都有不同于凋亡、自噬、坏死、焦亡等细胞死亡形式的独特表现。细胞发生铁死亡后具有免疫原性，可以放大炎症反应造成更多细胞死亡，最终诱发多器官功能衰竭^[6]。新近研究在肿瘤抑制、改善抗癌药物的心脏毒性及中枢神经系统退行性病变等多方面证明了铁死亡参与其发病^[7,8,9]，但铁死亡在脓毒症多器官功能障碍方面的研究尚有限。本文拟对近年来国内外铁死亡的分子机制及其在脓毒症多器官功能障碍中可能的作用机制的研究进展做一综述，以期为脓毒症的诊断、评估、监测与治疗提供新的思路与策略。

1　铁死亡

1.1　铁死亡的发生及调控过程

铁死亡是细胞内铁依赖的致死性磷脂过氧化，涉及铁超载、活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成、磷脂多不饱和脂肪酸增多等机制，可造成细胞膜完整性缺失、脂质交联干扰细胞膜正常功能及氧化损伤大分子物质及细胞结构，最终引起细胞死亡^[10]。铁死亡最终是通过磷脂氢过氧化物（phospholipid hydroperoxides, PLOOH）堆积导致^[11,12]。调控铁死亡的通路包括依赖谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase 4, GPX4）的传统途径和不依赖GPX4的途径。前者为系统Xc-谷胱甘肽（glutathione, GSH）-GPX4途径。此途径通过胱氨酸-谷氨酸反向转运蛋白摄取胞外的胱氨酸，在硫氧化蛋白还原酶1催化下生成半胱氨酸，进而合成GSH，参与GPX4介导的细胞中PLOOH的还原，减轻脂质过氧化。不依赖GPX4的途径为铁死亡抑制蛋白1（ferroptosis suppressor protein 1, FSP1）-泛醌系统、角鲨烯系统和二/四氢生物喋呤介导的脂质过氧化抑制系统，主要通过相应的还原反应、捕获内源性自由基等发挥抗氧化作用及抑制脂质过氧化^[10]。

1.2　铁在铁死亡中的作用

铁是驱动细胞内脂质过氧化和铁死亡的重要部分。细胞内过量的铁累积可激活炎症反应及促进脂质过氧化反应，破坏细胞膜结构、蛋白质及DNA^[13]。细胞内铁的来源主要有：细胞外铁通过转铁蛋白与转铁蛋白受体（transferrin receptor, TFRC）结合通过内吞作用被转运入胞内或铁蛋白通过铁自噬的方式释放大量铁。而膜铁转运蛋白（ferroportin, Fpn）是唯一的铁转出蛋白，它可以通过减少细胞内铁的含量减轻铁死亡。大量研究证实，通过调控上述与铁转运相关的蛋白可调控细胞内铁死亡的发生：敲除Fpn，过表达TFRC可诱导细胞铁死亡^[14,15,16]；而ferrostatin-1（Fer-1）可上调Fpn，降低细胞内铁含量，改善脂质过氧化和早期脑损伤^[17]。铁蛋白重链1（ferritin heavy chain 1, FTH1）是转铁蛋白的重要组成成分，它可通过发挥储铁功能而减少细胞内游离铁，也可与核受体辅助活化因子4（nuclear receptor coactivator4, NCOA4）结合通过铁自噬的方式降解铁蛋白释放大量铁，使胞质内Fe²⁺升高进一步激活线粒体膜跨膜蛋白的表达，将Fe²⁺转运至线粒体，引起线粒体脂质过氧化和死亡^[18]。研究发现敲除NCOA4可减少铁自噬，使细胞对脂质过氧化及铁死亡更具抵抗力^[19,20]。Tian等^[21]在帕金森病（Parkinson’s disease, PD）大鼠6-羟多巴胺（6-Hydroxydopamine, 6-OHDA）模型中发现敲除大鼠嗜铬细胞瘤来源的PC-12细胞中的FTH1基因可显著抑制细胞活力，引起线粒体功能障碍。反之，过表达FTH1基因可以使铁自噬受损，NCOA4表达下降，抑制铁死亡。Li等^[22]进一步研究发现在大鼠6-OHDA诱导的PD模型中过表达miR-335可使FTH1表达降低，FTH1是miR-335的直接靶点，miR-335通过靶向PD中的FTH1促进铁死亡。

1.3　系统Xc–GSH-GPX4途径与脂质过氧化

胱氨酸/谷氨酸反向转运体位于细胞膜上，是由轻链（solute carrier family 7 member 11, SLC7A11）和重链（solute carrier family 3 member 2, SLC3A2）组成的二硫键连接的异源二聚体，SLC7A11是调控其活性的关键成分。在正常情况下，谷氨酸被转移出细胞，同时胱氨酸转入参与GSH的形成，预防铁死亡^[23]。Erastin、柳氮磺吡啶（sulfasalazine, SAS）、细胞外高浓度谷氨酸、肿瘤抑制因子p53、BRCA1相关蛋白1（BAP1）和RAS选择性致死性小分子等可通过抑制系统xc-的SLC7A11亚基减少胱氨酸摄取或抑制系统xc-下游的GPX4引发细胞铁依赖性氧化损伤及铁死亡^{[24,25,26,27,28]}。这种氧化损伤可被去铁胺和铁抑素-1抑制^[5]。

多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid, PUFA）是细胞膜的组成部分，由于PUFA中较多的双键增加了其对氧化的敏感性，使其成为ROS攻击的主要目标。外源性给予单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid, MUFA）可通过与PUFA竞争进入磷脂而有效地抑制Erastin诱导的铁死亡^[29]。酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4）通过影响细胞膜脂质成分来改变细胞对铁死亡的敏感性。ACSL4使细胞膜中长链多不饱和ω6脂肪酸增加，使细胞对铁死亡敏感。进一步实验发现噻唑烷二酮类抗糖尿病药物可抑制ACSL4的表达改善铁死亡小鼠模型中的组织死亡^[30]。Yuan等^[31]发现ACSL4介导的5-羟二十四碳四烯酸（5-hydroxyeicosatatraeniocacid, 5-HETE）的产生导致了铁死亡，齐留通可抑制5-HETE表达继而限制了ACSL4过表达诱导的铁死亡。

[—多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids，PUFAs）是细胞膜脂质双分子层的重要组成部分^[30]，由于其分子结构中存在不稳定的碳-碳双键，因此对脂质的过氧化反应比较敏感^[31]。有研究表明，铁死亡是由含有PUFAs的磷脂过度氧化引起的^[32]。细胞内脂质过氧化的过程可大致分为非酶促脂质过氧化和酶促脂质过氧化两类。非酶促脂质过氧化是一种自由基介导的链式反应，而酶促脂质过氧化是指在脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）的催化下产生各种脂质过氧化氢。非酶促脂质过氧化即脂质自氧化，本质是氧驱动的自由基连锁反应^[33]。在细胞内有大量具有足够活性的自由基（如·OH）的情况下，脂质分子会泵出1个氢原子，产生脂质自由基，随后经泵氢、加成、断裂等不断重复的过程产生连锁反应。除非有足够数量的抗氧化剂来清除自由基，否则只要该反应占主导地位，氧化过程就不会停止^[34]。芬顿反应就是如此，因此也被认为是脂质过氧化代谢的自由基提供者^[35]。—]

GSH对于减轻脂质过氧化非常关键。它作为电子供体向GPX4催化的反应提供电子，将有毒的PLOOH还原成无毒的磷脂醇^[32]。GPX4是一种硒蛋白，含有硒代半胱氨酸。硒代半胱氨酸的结构类似于半胱氨酸，不同在于硒取代了硫。硒是哺乳动物生命所必需的。GPX4对硒半胱氨酸的利用对不可逆的过度氧化具有出色的抵抗力，而表达半胱氨酸变异型的细胞对过氧化物诱导的铁死亡高度敏感。硒代半胱氨酸作为催化部分，保证GPX4快速发挥还原作用，预防铁死亡^[33]。体内硒的含量影响GPX4的功能。在缺硒条件下，重组的GPX4催化活性降低1 000倍^[34]。Carlson等^[35]发现GPX4对于维持肝细胞存活和正常功能至关重要，维生素E的补充可以保护细胞减少GPX4缺乏引起的脂质过氧化损害。

1.4　不依赖GPX4的调节途径

目前对于铁死亡的研究主要集中在肿瘤学方面，发现不同的癌细胞株对GPX4抑制剂的敏感性差异很大，表明可能有其他因素控制着机体对铁死亡的易感性。Bersuke等^[36]发现FSP1是一个强劲的铁死亡抵抗因子，在细胞质中，可以作为一种氧化还原酶，还原泛醌。泛醌还原生成的泛醇是一种亲脂性自由基捕获抗氧化剂，阻止脂质过氧化的累积。Doll等^[37]也证明FSP1对GPX4缺失引起的铁死亡有保护作用，这个保护作用是FSP1通过泛醌介导的，泛醇捕获脂质过氧化产生的自由基，FSP1通过NAD（P）H催化泛醌的再生。FSP1-泛醌-NAD（P）H作为一个独立系统，与GSH-GPX4共同抑制磷脂的脂质过氧化和铁死亡。Brown等^[38]发现GTP环水解酶1通过其代谢产物BH4和BH2来预防铁死亡，机制可能是作为一种直接捕获自由基的抗氧化剂和参与泛醌的合成。

2　铁死亡在脓毒症多器官功能障碍中的研究进展

2.1　脓毒症的发病机制

脓毒症是机体对感染触发的免疫反应失调导致危及生命的器官功能障碍综合征，发病机制涉及炎症反应失调、免疫功能障碍、线粒体损伤、凝血障碍、神经内分泌网络异常、内质网应激、自噬等^[39]。脓毒症中致病微生物的重要生物代谢过程有铁的参与，如某些细菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌等的致病性依赖于铁，铁可以增加细菌的毒力、加速其生长，从控制感染、限制机体获取铁的角度出发，机体需要降低血清铁、增加细胞内不稳定铁，通过胞膜将铁与细菌隔离，这是机体的一种保护机制。但是细胞内过多的游离铁又会因为强氧化反应加剧炎症反应，触发细胞死亡^[40,41]。

不同病原体引起的脓毒症的共同发生过程是侵袭性病原体进入机体触发体内的固有免疫应答。巨噬细胞上的模式识别受体识别病原体相关分子模式激活免疫细胞，释放促炎细胞因子，引发细胞炎症因子风暴，过度的炎症反应最终导致机体的免疫抑制^[42,43,44]。调节性细胞死亡，如铁死亡，由炎症反应引起，而发生铁死亡的细胞释放损伤相关分子模式如高迁移率组蛋白B1（high mobility group box-1, HMGB1）等而具有免疫原性，会放大炎症反应和加重脓毒症^[45]。中和抗HMGB1抗体可以减轻铁死亡性细胞诱导的巨噬细胞炎症反应，提示HMGB1可以作为限制铁死亡相关炎症反应的治疗靶点^[46]。但是也有一些研究提示，铁死亡有可能抑制炎症反应，Oh等^[47]发现Erastin可以改善CLP或脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）诱导脓毒性休克小鼠模型的预后，机制与Erastin抑制脂多糖刺激骨髓源性巨噬细胞中的NF-κB信号通路，从而抑制炎症介质的释放有关。Arbiser等^[48]用一种神经酰胺类似物Solenopsin促进皮肤细胞铁摄入及铁死亡治疗银屑病，获得了显著疗效，提示铁死亡可能起到减轻炎症的作用。这些差异提示在不同情况下，铁死亡机制可能存在抗炎与促炎两种不同结局。如何阐明这些差异的发生条件及利用它对机体产生有益的影响是未来脓毒症研究的一个新方向。

2.2　脓毒症相关多器官功能障碍综合征

脓毒症后组织损伤和多器官功能障碍综合征的严重程度与铁积累的程度成正比^[49]。细胞内铁超载导致脂质过氧化及铁死亡在相应器官有不同表型，对此近年有大量机制及诊断方法方面的研究与创新。脓毒症性心肌病是脓毒症的一个常见并发症，虽然一定程度上可逆，但却增加脓毒症的病死率。已有研究证明细胞凋亡、自噬、焦亡、坏死参与脓毒症相关的心肌损伤，但确切机制尚无定论^[50]。Li等^[18]在LPS诱导的脓毒症心肌损伤小鼠和H9c2肌成纤维细胞中发现铁死亡标志物如前列腺素内过氧化物合酶2、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）和脂质ROS等，并导致线粒体明显损伤，线粒体的形态改变和发生铁死亡的细胞中线粒体一致。而Fer-1和右丙亚胺可减轻线粒体损伤，改善脓毒症小鼠心功能从而提高存活率，这提示铁死亡可能参与脓毒症性心肌病的发病机制。因此，探索与深究脓毒症心肌细胞铁死亡机制有望在未来提出预防和治疗脓毒症性心肌病的新策略。临床研究已经发现右美托咪啶（Dexmedetomidine，Dex）可以减轻脓毒症心肌损伤，Wang等^[51]通过动物实验进一步探讨了作用机制，在CLP构建的脓毒症小鼠模型的血清和心肌组织中发现，心肌损伤生物标志物、炎症因子、铁死亡靶向蛋白、炎症因子较对照组显著升高；血红素加氧酶-1（HO-1）、TFRC、裂解半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3、诱导型一氧化氮合酶和Gasdermin D的表达水平，以及铁浓度升高，而GPX4、超氧化物歧化酶和GSH的蛋白表达水平降低。Dex可以逆转上述变化，并进一步证实Dex通过增强GPX4降低脓毒症诱导的HO-1过度表达和铁浓度。因此，减少铁死亡，可能是减轻脓毒症心肌损伤的重要机制^[51]。

脓毒症患者中，约有70%的患者存在脓毒症相关性脑病，发病机制涉及神经炎症、神经细胞功能和信号改变、微循环受损导致的脑灌注不足、氧化应激和血脑屏障的改变^[52]。Wen等^[53]在脓毒症大鼠中证实了右侧海马区细胞凋亡率与磁共振波谱成像（magnetic resonance spectrum, MRS）测定的N-乙酰天冬氨酸/胆碱比值的相关性比与神经元特异性烯醇化酶和S100-β的相关性更为密切，表明MRS是研究大鼠脓毒症相关性脑损伤的一种无创的、敏感的早期诊断手段。定量磁化率成像已可以精确测量脑组织中的铁分布，临床上用于评估神经系统退行性疾病和炎症性疾病^[54]。此方法有望作为铁死亡的磁性生物标志物反映脓毒症相关性脑病中的铁沉积情况以及易感核团，协助探索其病理生理机制及评估病情严重程度。

脓毒症导致的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），铁水平的升高也是损伤机制之一。铁超载可促进肺泡上皮细胞脂质过氧化、中性粒细胞的迁移及促进成纤维细胞增殖，加重炎症反应和启动肺纤维化^[55,56]。在ARDS动物模型中检测到与铁死亡相关的指标升高（Fe²⁺、ROS、MDA），GSH降低；而铁死亡抑制剂可以减轻肺损伤，这个研究证明了铁死亡与ARDS发病机制可能相关^[57]。NOD蛋白受体3（NOD-like receptor protein 3, NLRP3）炎症小体和核因子红系相关因子2（nulcear factor erythroid 2-related factor 2, NRF2）是铁死亡中的关键分子，NLRP3炎性小体可以促进肺泡上皮细胞炎症和肿胀，导致ARDS^[58,59]。NLRP3已被证实是细胞焦亡的关键因子^[60]，铁死亡与细胞焦亡可能存在交互作用，共同参与ARDS发病机制。NRF2可以通过调控SLC7A11和HO-1的表达来减轻ARDS^[58]。上调NRF2的表达也可降低促炎细胞因子的水平，抑制铁死亡从而减轻ARDS^[61]。Yang等^[62]在人类支气管上皮细胞系BEAS-2B中用LPS和Fer-1处理后，检测细胞活力及MDA、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）、铁水平以及SLC7A11、GPX4蛋白水平，并在体内实验中观察LPS诱导脓毒症相关肺损伤的小鼠模型中肺组织的铁死亡水平。该研究发现LPS处理可下调BEAS-2B细胞的活力及下调铁中毒标志物SLC7A11和GPX4水平,增加MDA、4-HNE和总铁水平，且呈剂量依赖性；而加用Fer-1处理后阻断LPS处理效应。综上所述，调控铁死亡有望成为脓毒症所致ARDS的治疗靶点。

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）在脓毒症早期即可出现，在脓毒性休克患者中发病率占大约60%，尤其增加脓毒症相关死亡风险及进展为慢性肾脏疾病的风险^[63,64]。ROS诱导的急性肾损伤被认为是诱发或加重AKI中最关键的机制^[65]。铁死亡目前被认为在AKI中是一个很重要的治疗靶点^[66]。Friedmann等^[67]通过对GPX4缺陷小鼠的研究发现这些小鼠两周内死于大量的肾小管坏死和急性肾功能不全，而清除脂质过氧化产物可使它们存活时间延长35%。脂钙蛋白-2（lipocalin-2，Lcn-2）可以通过与血清中铁结合，造成病原体无法利用铁从而减轻脓毒症损害。Mertens等^[63]发现肾小管上皮细胞无铁的Lcn-2与肾脏的损伤相关，肾巨噬细胞释放的含铁的Lcn-2增加与肾功能恢复有关。

铁死亡可能也参与了脓毒症继发的急性胃肠功能障碍。铁超载的地中海贫血小鼠脓毒症表现较重的主要原因是铁诱导的肠黏膜损伤导致血清中脂多糖和（1,3）-β-D-葡聚糖的增加，铁离子对脂多糖和（1,3）-β-D-葡聚糖激活的炎症反应有扩增作用^[68]。此外，脓毒症诱导的免疫抑制常被认为是脓毒症后期治疗困难的原因之一。最近研究认为髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cell, MDSC）因为其免疫抑制特性在脓毒症中起推动作用^[69]。纳米氧化铁（Ferumoxytol, FMT）是FDA批准的补铁剂，Xue等^[70]证明FMT通过降低精氨酸酶-1和ROS的产生来降低MDSC的免疫抑制功能，提示FMT可以减轻脓毒症中后期的免疫抑制。

3　针对铁死亡的靶向干预进展

在脓毒症及脓毒症多器官功能障碍的铁死亡干预方面，除了常见的铁螯合剂和抑制剂外，越来越多的研究致力于对铁死亡相关基因的研究，以寻找潜在的诊断和治疗靶点。Dai等^[71]通过Gene Expression Omnibus数据库及加权基因共表达网络分析发现了LPIN1有希望成为预测脓毒症患者生存率的可靠生物标志物。Chen等^[72]发现铁死亡相关基因Hmox1、Slc3a2、Jun和Zfp36与脓毒症肝衰竭显著相关，有可能为该病的诊治提供靶点。

4　结论

本文从铁死亡的发生机制和主要调控途径及其在脓毒症相关器官损伤中的作用机制等方面综述了近年来相关研究成果。铁死亡研究在肿瘤学、神经系统疾病的发病机制方面已经有了丰硕成果；但其在脓毒症相关研究领域，有很多问题亟待解决。首先，脓毒症时铁的异常代谢在脓毒症早期可能是机体进化的一个保护机制——可减少病原体的毒性，但弊端则是触发与加重机体的脂质过氧化和级联炎症反应。其次，脓毒症目前缺乏可靠的指标用以诊断与评估预后，而铁与铁死亡相关的生物标志物是一个非常有前景的方向。第三，铁相关的纳米诊断技术已在早期诊断脓毒症方面表现出了巨大潜力，与传统的血培养方法相比其诊断时间可缩短到1.5 h以内，且因为其强光动力效应，可实现体外血液消毒^[73]，为治疗脓毒症提供了新方法及新思路。最后，精准调控铁死亡的效应分子机制有望成为治疗脓毒症多器官功能障碍的新策略与新靶点。