多组学技术使全面分析脓毒症相关急性肾损伤成为可能

研究背景

脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)是危重病人的常见并发症，发病率和死亡率高。脓毒症包含了一系列不同类型的疾病：自2016年脓毒症和脓毒症休克(Sepsis-3)的定义被提出，SA-AKI 通常被定义为累及肾脏的脓毒症或感染性休克，导致肾功能进行性下降。脓毒症休克是脓毒症的一个子集，与单纯脓毒症相比，其在血液循环、分子和代谢异常中的死亡风险更高。作为单独的综合征，脓毒症和AKI使宿主相互易感，临床上往往很难确定这两种综合征的确切发病时间。

SA-AKI在疾病表现、疾病进展和治疗反应方面存在很大差异，具有潜在异质性。随着多组学技术的逐渐成熟，本篇综述作者旨在将多组学数据整合到SA-AKI的研究中，重点介绍了多组学技术在SA-AKI研究中的应用以及多组学方法的新技术和前景。

1. SA-AKI的病理生理机制

当前，对SA-AKI的发病机制仍然知之甚少，对SA-AKI的大部分研究大多数基于脓毒症动物模型、体外细胞研究以及对败血症患者死亡后的观察研究。其中，SA-AKI 动物模型提供了在人类样本中无法获得的复杂和侵入性测量观察数据而受到广泛应用。接下来作者介绍了当前对于SA-AKI研究的主要实验动物模型。

1.1 SA-AKI模型

在以小鼠和大鼠为代表的哺乳动物中，主要有三种SA-AKI建模方法：内毒素直接给药，将脂多糖(LPS)直接注射到腹膜或静脉注射；盲肠结扎穿刺(CLP)或腹腔内植入粪便和尿液；细菌植入模型是将细菌浸渍放置在需要的位置(腹膜或血管内)，最常见的是纤维蛋白凝块。应用最广泛的动物模型是前两种。在最近的一项前瞻性对照研究中，脓毒症休克羊模型被广泛用于使用革兰氏阴性菌在体内研究SA-AKI，并评估脓毒症休克患者的肾功能、组织学和肾小球超微结构。克服了内毒素模型的不足，支持早期SA-AKI代表肾功能不全的观点。

作者认为，理想的脓毒症动物模型应该无误地将动物研究的相关信息转化为人类条件。但小鼠内毒素血症模型与人类基因改变的相关性很低。与小鼠相比，猪具有相似的细胞因子和免疫细胞谱系，并表现出人类感染的特征性状，且猪在解剖学和生理学上与人的肾脏相似，具有更宏观的解剖结构，因此猪可能是研究SA-AKI更合适的动物模型。

1998年5月在洛克菲勒大学举行的关于脓毒症发病机制会议上讨论了2次感染模型（2-hit models）解释致命性脓毒症休克过程的优点和“multi-hit”协同阈值假说。2次感染模型的发展使研究人员能够确定炎症介质在损伤后感染易感性中的作用，并创建2次感染模型，复制临床情况，产生不同的损伤特异性炎症模式，从而解释在败血症中发生的复杂相互关系，多种2次感染模型均已用于对脓毒症发病机理的研究。虽然人类和小鼠在暂时性炎症和宿主基因组反应模式方面有相似之处，但小鼠的免疫系统更有抵抗力。

目前，大多数动物研究使用年轻、健康、无共病的模型。一项研究采用创伤/出血2-hit模型和盲肠结扎穿刺模型分别对3、15、20月龄的雌性和雄性CD-1小鼠进行实验。这项研究表明，年龄/性别在生存方面的差异虽然具有不可否认的影响，但并没有反映在相应群体之间描述的反应模式中。性别/年龄对于脓毒症临床结局的影响需要进一步的实验和临床研究。

1.2 病理生理机制

由于SA-AKI可以在没有肾灌注不足和血流动力学不稳定的临床症状以及存在正常或增加的全肾血流量的情况下发生，因此逐渐认识到缺血再灌注损伤不是SA-AKI的唯一机制（图 1）。SA-AKI的病理生理学涉及多种细胞类型的损伤和功能障碍，包括巨噬细胞、血管内皮细胞(ECs)和肾小管上皮细胞(TECs)，以及它们之间的相互作用和关联。越来越多的证据表明，SA-AKI的发病机制是多因素和复杂的，涉及炎症、微循环功能障碍和代谢重编程之间的相互作用。

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图1 SA-AKI的临床病程及病理生理

1.2.1炎症及免疫反应

炎症失调是包括肾损伤在内的许多下游并发症的主要原因。事实上，炎症反应越明显，就越有可能导致直接的肾脏损伤。巨噬细胞在先天免疫中起着重要作用。宿主反应的第一阶段涉及病原体相关分子模式(PAMP)结合先天免疫细胞的模式识别受体(PRR)，如Toll样受体，触发参与早期先天免疫反应的下游信号级联，导致促炎细胞分子和趋化因子的合成和释放。肾小管上皮细胞(RTECs)也表达Toll样受体，尤其是TLR2和TLR4。在SA-AKI向CKD发展过程中，具有特定表型的驻留细胞经历去分化，然后是增殖和再分化。巨噬细胞在这一过程中起着重要作用。除了上述促炎表型外，巨噬细胞还具有促纤维化表型，刺激成纤维细胞和肌成纤维细胞，伴有I型和III型胶原蛋白和纤维连接蛋白的沉积。

1.2.2 内皮损伤与微循环功能障碍

脓毒症刺激内皮细胞产生一氧化氮，导致血管扩张，失去自我调节，导致内皮功能障碍。内皮细胞间接触的改变是由VEGF、VEGFR2、Ang、VE-cadherin和配体粘附分子之间的相互作用以及内皮细胞和白细胞之间复杂的相互作用介导的，这些相互作用允许白细胞通过。此外，在脓毒症期间，与炎症相关的微血管血栓形成，细菌病原体相关的分子模式在PRR表面的内皮细胞、血小板和白细胞中被发现，细菌内毒素还可以刺激组织因子表达和初始激活增加纤溶酶抑制剂1(PAI-1)水平，阻断纤维蛋白溶解和随后启动凝血过程促进微血管血栓形成。

1.2.3 RTECs凋亡细胞死亡与亚致死损伤

在RTECs中，炎症细胞浸润和大量炎症因子导致肾功能恶化、凋亡细胞死亡和亚致死性损伤。在SA-AKI向CKD进展过程中，与免疫细胞一样，TECs早期代谢重编程为有氧糖酵解，可提高耐药和耐受性。此外，可能会发生表观遗传变化，细胞周期停滞在G2/M期，结缔组织生长因子和TGF-β显著增加。

1.2.4 代谢重编程

在肾脏的各种细胞类型中，RTECs是肾脏中代谢最活跃的细胞，对脓毒症相关损伤非常敏感。在正常生理条件下，氧化磷酸化(OXPHOS)产生ATP，为95%以上的细胞能量，而有氧呼吸是产生ATP的主要机制。然而，在SA-AKI过程中，RTECs可能首先转化为糖酵解，将丙酮酸转化为乳酸，这是一种低效的产生ATP的机制。抑制有氧糖酵解和诱导OXPHOS可降低AKI易感性，显著提高生存率。随着ATP水平的降低，腺苷一磷酸活化蛋白激酶(AMPK)被激活，一方面导致糖酵解、FA氧化和葡萄糖转运能力的增加。AMPK的晚期激活可能最终通过细胞存活和线粒体生物发生来稳定能量平衡。线粒体的功能是细胞代谢和代谢重编程的重要组成部分。脓毒症会导致显著的线粒体损伤和线粒体质量控制过程的激活，如线粒体自噬(受损的线粒体被吞噬到细胞中回收)、生物发生(新的功能性线粒体合成)或对细胞信号通路的干扰，如Akt/mTORC1/HIF-1a通路。因此，OXPHOS诱导或促进OXPHOS调节剂对线粒体功能的影响与脓毒症患者肾功能和生存率密切相关。

2. SA-AKI的诊断或治疗干预

SA-AKI的预防是复杂的，大多数患者在寻求治疗时已经表现出明显的肾功能不全。在治疗上，SA-AKI在很大程度上仍然是支持性和非特异性的。因此，SA-AKI迫切需要找到更有效的预防和干预方法。结合多组学研究，可以更深入地了解SA-AKI的发病机制，为个体化治疗提供可能。下面作者讨论了SA-AKI现有的预防干预措施。

2.1 抗生素及源头控制

通过使用转录组学和/或代谢组学分析来改进宿主反应监测，描述了几种以免疫治疗为目标的新型干预措施。一个有希望但失败的尝试的例子是靶向Toll样受体(TLR)的药物。此外，一种新型的表观遗传治疗可以调控脓毒症期间免疫细胞中基因转录的表观遗传过程的干扰，从而恢复免疫功能的可能性。SIRT1抑制剂EX-527是一个小分子-SIRT1结合位点，可以关闭NAD+，增加腹腔白细胞积聚，改善腹腔细菌清除，在小鼠腹腔脓毒症中表现出显著的保护作用。

2.2 液体复苏

液体复苏是感染性休克管理的基石。首先适度输注复苏液(前3小时内30ml /kg)，然后动态测量液体反应性，以确定是否需要液体或血管活性药物。有明确的证据表明，过度复苏对急性肾损伤也是有害的。然而，ProCESS试验的补充性分析集中在长达1年的肾脏结局，发现使用早期目标导向治疗、替代复苏或常规护理并不影响新的AKI的发展、AKI严重程度、液体超载、RRT需求或肾功能恢复。

2.3 血管活性物质

以SA-AKI为例，几个大型多中心试验研究了传统药物，如去甲肾上腺素、肾上腺素、加压素和多巴胺，以及更新颖的药物，如血管紧张素II和左西孟丹。去甲肾上腺素推荐作为感染性休克的一线治疗药物，抗利尿激素是公认的感染性休克的一线治疗药物。一项对接受RRT治疗的患者的小亚组分析显示，接受血管紧张素II的患者比安慰剂需要更少的RRT，更有可能存活到28天(53% vs 30%;P=0.012)，结果需要在更大的SA-AKI队列中验证。

2.4 药物治疗

另一种治疗败血症的方法是保护个别器官。在临床前和小型临床研究中，重组人碱性磷酸酶(AP)通过内毒素直接去磷酸化对SA-AKI具有保护作用，可减少炎症和器官功能障碍，提高生存率。在最近一项针对301例SA-AKI患者的国际随机、双盲、安慰剂对照适应性IIa/IIb期研究中，发现1.6 mg/kg是最佳剂量，与安慰剂相比，短期肾功能没有显著改善。然而，AP的使用与28天死亡率的降低相关。硫胺素缺乏与无氧代谢和乳酸增加有关，添加硫胺素可改善脓毒症患者的线粒体功能。在一项单中心、随机、双盲、安慰剂对照试验的二次分析中，随机静脉注射硫胺(200mg，每天两次，连续7天)的患者的AKI严重程度较低，接受RRT的患者较少。许多其他化合物正在被积极研究用于败血症，如瑞莫德、吡非尼酮缓释、左卡尼汀和益生菌。

2.5 肾替代疗法

建议对发展为AKI并需要肾替代疗法（RRT）的成人脓毒症/脓毒症休克患者使用连续或间歇肾替代治疗。RRT开始的时间(早期和延迟策略)对SA-AKI的影响鲜有研究。早期开始RRT可以通过限制全身炎症、液体过载和器官损伤改善预后，但目前没有具体的RCTs来确定SA-AKI中启动RRT的最佳时间。新的潜在生物标志物可以预测AKI的严重程度，如TIMP-2 x IGFBP-7，可能有助于确定在这种情况下何时开始RRT。

3. 组学时代及其对SA-AKI研究的影响

目前SA-AKI是根据临床症状来定义的，在疾病表现、进展和治疗反应方面存在相当大的差异，这突出了潜在生物学机制的异质性。因此，临床医生在考虑最佳治疗和风险预测时遇到很多不确定性。如今，组学技术正在迅速发展，可以从SA-AKI基因型-表型的个体和患者群体中获得大量数据集（图2）。

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图2 SA-AKI的多组学示意图

从关注单个分子或通路的功能到将生物系统作为一个统一的整体进行分析，整合生物学的根本转变是组学技术的发展方向。结合这些高维数据集，机器学习等计算方法为将患者重新分类到分子定义的亚组提供了机会，这些亚组更好地反映潜在的疾病机制，最终目标是改善SA-AKI患者的诊断分类、风险分层和分子疾病特异性治疗的分配。因此，作者在此节分别讨论了个体组学技术在SA-AKI研究中的应用，表1部分展示了当前对SA-AKI的组学研究。

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表1 SA-AKI的组学研究部分展示

3.1 组学技术介绍及其在SA-AKI中的应用

基因组学

基因组学用于识别个体遗传变异和疾病易感性，研究特定位点相对较少的个体遗传性状。人类外显子组占基因组的比例不超过2%，但它包含了已知与疾病相关的约85%的变异，这使得全外显子组测序成为全基因组测序的一种具有成本效益的替代方法;DNA微阵列技术依赖于核酸杂交来检测SNP和CNVs的存在，多数研究使用大规模的基因组方法来识别SNP，使用特定疾病已知变异的微阵列来识别与SA-AKI相关的遗传变异。

表观基因组学

表观基因组学通过表观遗传变化(如DNA甲基化、组蛋白修饰和非编码RNA表达的变化)调控基因转录。SA-AKI的研究目前主要集中在动物研究上。未来对脓毒症机制的研究可能旨在整合表观基因组学和转录组学，以确定甲基化、组蛋白修饰和非编码转录对转录组变异的影响程度。

转录组学

转录组学是对特定细胞、组织或个体在特定时间和状态下转录的完整基因转录或RNA类型的研究。它既包括翻译成蛋白质的编码RNA，也包括参与转录后控制的非编码RNA，后者进一步影响基因表达。目前已广泛应用于基础研究、临床诊断、药物开发等领域。

蛋白质组学

随着组学技术的发展，研究已转向对细胞蛋白翻译产物和RNA转录本的分析。对尿液、血浆和组织样本的高通量蛋白质组学分析已经确定了新兴的生物标志物和药物靶点。在小鼠CLP脓毒症模型中，利用组织Proteomics-Dige和MALDI-Tof/TOF MS技术鉴定磷酸化的MYL12B作为SA-AKI早期诊断的潜在血浆生物标志物。最近的一些研究已经确定了几种有希望的疾病发生和进展的候选标记蛋白，并进一步确定了SA-AKI及其向CKD过渡的特异性通路。

代谢组学

代谢组学是指在生理或病理条件下，对血液、组织等生物样本中小于1000道尔顿的分子代谢物进行全面系统的鉴定和定量分析，可以更准确地描述任何条件下活性的细胞过程。代谢组学研究主要使用两种方法来检测代谢物:核磁共振(NMR)和液相色谱/质谱(LC/MS)，两者各有利弊。代谢物是生物活动的最终产物，是反映生理表型最直接、最全面的生物标志物。越来越多的研究表明，能量代谢途径的改变，也被称为代谢重编程，是SA-AKI病理生理的重要因素。因此，研究SI-AKI的代谢变化，识别其早期生物标志物，对临床早期诊断和治疗具有重要意义。

3.2 SA-AKI中的组学技术

对于SA-AKI的相关研究主要集中在现实世界中对患者的前瞻性和观察性队列研究，组学技术的研究还很少。尤其是多组学，可能会对SA-AKI的病理生理机制以及SA-AKI的诊断或治疗干预进行更深入的探索和分析，这是组学技术在SA-AKI中进一步研究的方向。多种组学技术的整合为提高我们对AKI的理解以及从AKI向CKD转变背后的驱动力提供了新的可能性。

3.3 SA-AKI的新型生物标志物

新兴生物标志物在不同肾综合征(包括SA-AKI)中的作用是一个快速增长的研究领域。在脓毒症患者中，早期发现AKI对于提供最佳治疗和避免进一步的肾脏损害至关重要。表2从炎症、内皮损伤、小管损伤和AKI风险标志物等方面总结了SA-AKI的一些生物标志物，以便在治疗最有效的时候提供预防和早期诊断。

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表2 SA-AKI的生物标志物概述

在较新的生物标志物中，中性粒细胞明胶酶相关脂质载体蛋白(NGAL)、肾损伤分子1(KIM-1)、肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)和胱抑制素C(Cys C)可加速SA-AKI的诊断。NGAL是研究最广泛的肾生物标志物，SA-AKI中NGAL表达不一致，研究表明尿NGAL对SA-AKI的特异性高于血浆NGAL，然而这些生物标志物缺乏进一步分层SA-AKI风险的能力。

3.4 肾脏疾病组学数据库

组学数据库提供了关于分子功能取向和表达的最新信息，存储了关于已经进行过类似实验的信息，有助于研究设计，是研究肾脏疾病的一个有价值的工具。对于临床实践，系统生物学方法和高通量技术推动医学革命从被动到主动和预防，通过强大的计算方法，发现新的生物标志物。诊断工具的发展，以阐明发病机制，并为患者筛选、诊断、预防和治疗的可能疗法创建模型。组学研究正在进行中，并有望在未来十年内逐步引入临床实践。在这篇综述中，作者描述了通用的组学数据库，以及肾脏疾病的特定数据库(表3)。

表3 组学数据库和肾脏特异性数据库部分展示

4. 多组学整合

大量研究表明，多组学数据集的整合已应用于广泛的生物学问题，有助于揭示多组学层面的潜在机制。虽然目前SA-AKI的组学研究主要集中在单个组学研究上，但结合多种组学技术来解决SA-AKI的三个关键问题的研究较少。作者在此也列举了几个组学整合的研究，例如：①基于多组学特征的SA-AKI亚型及分类。②SA-AKI的预后生物标志物，包括疾病诊断和驱动基因。③了解SA-AKI的病理生理机制。

5. 新技术和未来展望

随着新技术和新方法的发展，我们对疾病的理解可能会产生迅速和革命性地发展。例如，scRNA-seq和单核RNA-seq (snRNA-seq)等技术提供了在细胞水平上了解SA-AKI的分子过程，人工智能旨在提前准确预测SA-AKI的发病。在未来的应用中，组织样本或整个器官可以通过这些技术的组合进行分析，生成空间多组学数据集，这有望为系统的研究分子生物学提供前所未有的见解。

5.1 整合基于微阵列的空间转录组学和单细胞RNA测序

ScRNA-seq提供了单细胞转录表达的详细信息，允许在细胞间分析RNA表达差异。目前关于SA-AKI单细胞RNA测序技术的研究较少。由于不同肾脏微环境和相互作用下细胞类型的异质性(如上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞、血管平滑肌和免疫细胞)，SA-AKI对肾脏中各种细胞的影响不同。scRNA-seq使研究人员能够检测到混合群体细胞之间的高可变基因(HVGS)，这是bulk RNA-seq无法实现的。scRNA-seq数据的一个重大挑战是将RNA图谱与其在组织中的位置(空间信息)进行匹配。空间转录组测序提供完整的组织空间定位信息，通过向scRNA-seq数据添加空间信息，使不同单细胞亚群的空间定位成为可能，增加了对特定细胞亚群及其在发育、内稳态和疾病中的相互作用的了解。

5.2 人工智能（AI）

人工智能是一门旨在理解和设计显示智能过程的计算机系统的科学学科。机器学习(ML)是人工智能的一个子集，可以在临床症状出现之前检测疾病的发作，从而采用更主动的方法。在机器学习中，监督学习和强化学习被广泛应用。在对人工智能在败血症临床应用的叙述性综述中，有15篇文章关于使用AI模型诊断败血症，达到了最佳性能的模型0.97 AUROC;7篇预后文章，预测随时间推移的死亡率，AUROC高达0.895;3篇关于帮助治疗脓毒症症的文章。结合其他生物标志物和组学数据，该方法可以进一步加快SA-AKI新的生物标志物和失调通路的发现。

自此，文章的大体内容就介绍完啦。总结一下，作者以脓毒症相关急性肾损伤(SA-AKI)为背景，总体上分为三部分：