血小板在脓毒症和感染性休克患者中的诊断和预后作用

摘要：关于血小板计数研究通常只包括危重患者，而对脓毒症和感染性休克患者预后影响的数据有限。因此，该研究调查了血小板计数在脓毒症和感染性休克患者中的预后作用。单中心纳入2019年至2021年连续的脓毒症和脓毒性休克患者从疾病发作当天（第1天）、第2、3、5、7和10天采集血样。首先，检测血小板计数对感染性休克的诊断价值。其次，测试了血小板计数对30天的死亡率预后价值。统计分析包括单变量t检验、Spearman相关性、C统计、Kaplan–Meier分析，以及多变量混合方差分析(ANOVA)、Cox比例回归分析和倾向得分匹配。共有358名脓毒症和感染性休克患者被纳入，血小板计数中位数为176 ×106/ml。血小板减少症（即<150×106/ml）的存在与30天死亡率的风险增加相关（HR=1.409；95% CI1.057–1.878；p=.019），这在倾向性研究后仍然得到证实分数匹配。在脓毒症过程中，在脓毒症第5天观察到最低点，平均血小板计数减少21.5%。尤其是血清乳酸、平均动脉压和恶性肿瘤的存在被发现可以预测脓毒症/感染性休克过程中的血小板下降。血小板下降>25%与30天的死亡率风险增加相关（HR =1.484；95% CI1.045–2.109；P =.028）血小板下降后，从第5天到第10天观察到恢复（平均增加 7.5%）。然而，未发现与血小板恢复30天死亡率相关（HR =1.072；95% CI0.567–2.026；P=.832）。总之，脓毒症过程中的血小板减少和血小板下降都与因脓毒症或感染性休克入院的患者30天的死亡率风险增加有关。

介绍：脓毒症的特征是宿主对感染的反应失调，并可能导致危及生命的器官功能障碍。尽管脓毒症的治疗最近有所改进，包括早期目标导向治疗和改善对治疗指南的依从性，但脓毒症仍然与显着的发病率和死亡率相关。特别是在感染性休克的情况下，短期死亡率高达60%。这可能是多器官衰竭导致内皮功能障碍伴高通透性、微血管血栓形成和严重缺氧的结果。

在脓毒症期间，止血改变的范围从亚临床到不受控制的凝血激活。血小板在脓毒症和感染性休克中起着核心作用，因为它们会影响止血和免疫反应。40多年前首次研究了它们在脓毒症中的作用。在多达50%的脓毒症患者中观察到血小板减少。血小板减少症可能由中央血小板生成减少以及外周过度消耗（即血小板膜受体激活、噬血细胞作用或弥散性血管内凝血(DIC)引起。

在各种研究中调查了血小板计数和血小板参数（例如平均血小板体积(MPV)）对预后的影响。虽然一些研究表明血小板计数与短期全因死亡率相关，但其他研究并未将血小板计数确定为脓毒症和感染性休克患者死亡率的预测因子。然而，这些研究中的大多数包括危重患者（包括外伤和手术患者）的异质研究人群，或者仅限于入院时的单次血小板测量。

本研究调查了血小板在感染性休克诊断中的诊断作用，以及血小板计数对入住内部重症监护病房(ICU)的脓毒症和感染性休克患者的预后影响。最后，该研究调查了脓毒症和感染性休克过程中血小板下降和血小板恢复的预后影响。

方法

研究患者，设计和数据收集

本研究前瞻性纳入了2019年6月至2021年1月期间在德国曼海姆大学医学中心(University Medical Center Mannheim)住院时出现脓毒症或感染性休克的所有患者。与索引事件相关的所有临床数据均使用电子医院信息系统以及在ICU实施的IntelliSpace重症监护和麻醉信息系统(ICCA, Philips, Philips GmbH Market DACH, Hamburg, Germany)进行记录，组织患者数据，包括入院文件、生命体征、实验室值、治疗数据和会诊记录。

在发病(即第1天)以及第2、3、5、7和10天评估脓毒症和脓毒性休克的存在，以及重要的实验室数据、脓毒症相关评分、血流动力学测量和通气参数。

记录的其他数据包括基线特征、既往病史、指数住院时间、影像学诊断数据以及药物治疗。在常规临床护理中，由重症监护医师和ICU护士对源数据进行记录。

本研究来源于“曼海姆脓毒症和脓毒性休克登记”(MARSSregistry)的分析，代表了一项前瞻性单中心登记，包括德国曼海姆大学医学中心(UMM)内科重症监护室急性入住的连续脓毒症或脓毒性休克患者(clinicaltrials.gov标识符:NCT05231720)。登记工作是根据《赫尔辛基宣言》的原则进行的，并得到德国海德堡大学曼海姆医学院第二医学伦理委员会的批准。

纳入和排除标准、研究终点 

对于本研究，包括所有连续的脓毒症和感染性休克患者。根据脓毒症第1天的血小板计数（即<150×106/ml与≥150×106/ml）进行风险分层。在脓毒症第1天没有血小板计数证据的患者被排除在本研究之外。没有应用其余的排除标准。

脓毒症和脓毒性休克的诊断依据《脓毒症和脓毒性休克第三次国际共识定义》。因此，脓毒症被定义为危及生命的器官功能障碍，由宿主对感染的反应失调引起。器官功能障碍定义为序贯器官衰竭评估(SOFA)评分增加≥2。感染性休克被定义为持续性低血压，尽管进行了充分的容量复苏，需要血管加压药来维持平均动脉压(MAP)≥65mmHg和血清乳酸≥2mmol/l。在30天的死亡率方面，没有患者失访。

血小板计数的测量

在配备总共3个XN-10分析仪（均为Sysmex，Norderstedt，德国）的全自动XN-9000平台上，按照标准从乙二胺四乙酸 (EDTA) 钾全血样本中进行血小板计数。分析系统使用多阶段算法。初始PLT计数基于阻抗测量。如果出现任何异常情况，例如血小板大小直方图或血小板计数低于预设限值，则会启动反射测试程序。使用基于荧光的检测技术再次确定样本。细胞的这种荧光标记发生在细胞膜被特定裂解试剂穿孔后。血小板用基于氧胺的荧光染料染色。结果以图形方式显示，纵坐标为前散射光(FSC)光，表示细胞大小，横坐标为侧荧光(SFL)光，给出细胞DNA/RNA含量的信息。如果血小板-f测定后总是有血小板减少低于100，或者如果仪器指示血小板异常或血小板团块的存在，将准备血液涂片。在May-grnwald染色涂片中，实验室技术人员检查30-50个视野以排除血小板聚集形成。

统计方法

定量数据以均值±标准误差(SEM)、中值和四分位数间距(IQR)以及取决于数据分布的范围表示。使用针对正态分布数据的 Student’s t检验或针对非参数数据的Mann–Whitney U检验对它们进行了比较。通过Kolmogorov–Smirnov检验检验高斯分布的偏差。定性数据以绝对频率和相对频率表示，并酌情使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。创建了白细胞(WBC)计数、血小板计数和血小板与白细胞比率(PWR)的箱线图，用于比较脓毒症患者和脓毒症第一周第 1、3、5 天的脓毒症和感染性休克患者,7和 10.Spearman对非参数数据的等级相关性用于检验第1天血小板计数与医学和实验室参数的关联。

血小板计数的诊断性能

通过计算接受者操作特征(ROC)曲线并研究整个队列中相应的曲线下面积(AUC)来应用C统计量，以评估白细胞(WBC)计数、血小板计数的诊断性能以及在脓毒症发作的前10天（即第 1、3、5、7和10天）诊断脓毒性休克和脓毒症的血小板与白细胞比率 (PWR)。使用Hanley等人的方法比较诊断性能的AUC。在ROC分析之后，约登指数的最大值被用来确定血小板计数的最佳临界值，以区分感染性休克和脓毒症患者。

血小板计数的预后表现

通过计算ROC曲线和整个队列中关于30天的死亡率的相应AUC，应用第1、3、5、7 和10天血小板计数的预后表现的C统计量。使用Hanley等人的方法比较预后表现的AUC。

通过使用混合因子方差分析(ANOVA)分析随时间变化的血小板计数（第1、2、3、5、7 和10天），以估计时间和存活这两个因素对生物标志物水平的影响。在具有统计学显著性的Levene检验的情况下，应用单因素重复测量方差分析，以便仅评估时间对特定组的生物标志物水平的影响。通过使用Mauchly检验来测试球形度，并在不满足球形假设的情况下对混合方差分析结果应用 Huynh–Feldt校正。

在整个研究队列中根据血小板计数进行了Kaplan-Meier分析。单变量风险比(HR)与95%置信区间一起给出。此后，使用“前向选择”选项开发了多变量Cox回归模型，其中仅包括统计显着变量(P<0.05)并同时进行分析。

根据血小板计数(即<150×106/ml vs.≥150×106/ml)对整个研究队列进行倾向评分匹配，并采用非简约多变量logistic回归型。根据以下自变量:年龄、性别、糖尿病、心房颤动、感染源、格拉斯哥昏迷量表(GCS)、入院时机械通气需求、呼吸频率、收缩压、血清乳酸和PH值进行倾向评分。根据logistic回归统计的倾向评分值，每例患者在对照组中发现1例倾向评分值相近(倾向评分值接受差值<5%)。在倾向评分匹配亚组中，应用Kaplan-Meier方法，给出单变量HR和95%置信区。

脓毒症过程中血小板计数的动态变化

使用单变量和多变量logistic回归分析评估血小板下降的预测因子(定义为血小板计数从第1天到第5天下降>25%)。采用Kaplan-Meier法研究血小板下降(即第1天至第5天血小板计数下降>25%，第5天血小板计数<150×106/ml)与血小板计数稳定高(即第1天和第5天血小板计数≥150×106 /ml)和血小板计数稳定低(即第1天和第5天血小板计数<150×106/ml，血小板计数下降>25%)患者对30天全因死亡率的预后影响。最后，研究血小板恢复(即第5天至第10天:血小板计数增加>25%，第5天<150×106/ml)与血小板计数稳定高(即第5天和第10天:≥150×106/ml)患者和血小板计数无恢复(即第5天和第5天:<150×106/ml，血小板计数恢复>25%)患者的预后影响。p≤0.05认为所有统计检验结果显著。使用SPSS(Version 25,IBM,Armonk,New York)和GraphPad Prism(Version 9, GraphPad Software,San Diego,California)进行统计。

结果

研究人群

在总共361名脓毒症或感染性休克患者中，3名入院时血小板计数缺失的患者被排除在外。最终研究队列包括358名患者（中位血小板计数176×10细胞/ml，IQR107–267×10细胞/ml）。脓毒症第1天血小板减少（即血小板 <150×10/ml) 在41% 的脓毒症和感染性休克患者中观察到。如表1所示，患者的中位年龄为70岁，大多数患者为男性(64%)。特别是心血管危险因素和合并症，例如冠状动脉疾病的发生率（36%对32%；P= .464）、充血性心力衰竭（23%对17%；P= .196）和心房颤动（28%对 27%；P= .867），在第1天感染性休克和脓毒症患者之间没有差异。相比之下，感染性休克患者更容易患恶性肿瘤（39%对28%；P =.026）。与此相一致的是，与脓毒症患者相比，感染性休克患者的LVEF<35%（19%与12%；P= .001）和心肺复苏率更高（19%与 0.001）。6%；P= .001) 表1。

图 1.显示脓毒症和脓毒症休克患者在脓毒症发作前10天（即第1、3、5、7 和10天）期间WBC、血小板计数和PWR的分布的箱线图。数据显示为具有四分位数范围（框）和5-95%百分位数的中位数。

图 2. 倾向评分匹配后30天血小板计数对全因死亡率的预后影响。

ICU住院期间的血小板计数

在整个研究队列中，血小板计数在第5天达到最低点(174±122×106细胞/ml)，与基线血小板计数相比下降了21.5%。当对30天存活者和非存活者进行分层时，在ICU治疗的第一周，非存活者每天的血小板计数明显较低(图3)。与此一致，非幸存者(平均第7天129±99×106细胞/ml)比幸存者(平均第3天200±119×106细胞/ml)观察到的最低点晚。在初始血小板减少(血小板<150× 106 /ml)的患者中，血小板计数从第1天到第10天持续恢复(血小板计数平均增加41.1%)。相比之下，没有初始血小板减少的患者显示血小板计数持续下降(血小板计数平均下降27.5%)。值得注意的是，在初始血小板减少的情况下，中度血小板减少(血小板50- 149×106 /ml)(血小板计数平均增加33.7%)和重度血小板减少(血小板<50×106 /ml)(血小板计数平均增加260%)的患者中都观察到血小板恢复(图3)。

脓毒症过程中血小板下降

在整个研究队列中，多变量logistic回归分析显示，特别是恶性肿瘤的存在(OR=3.300;95% CI1.431-7.609;P= .005)，更高的乳酸水平(OR=1.332;95% CI 1.116-1.589;p= .001)和较低的平均动脉压(MAP)(OR=0.972;95% CI 0.945-0.996;p= 0.024)与第5天血小板下降>25%相关。与血小板计数持续高的患者相比，第1天至第5天血小板下降>25%与30天全因死亡风险增加相关(60%vs. 31%;Hr=2.456;95%CI 1.525-3.955;P= .001)。同样，与血小板计数持续高的患者相比，血小板计数持续低的患者也与30天的死亡率风险增加相关(50%vs31%;HR1.808;95% CI 1.004-3.256;p= .049)。

脓毒症过程中的血小板恢复

在ICU住院第5天达到最低点后（174±122×10细胞/ml），观察到血小板恢复直至第10天（187±125×10细胞/ml），平均增加7.5%。最后，血小板计数恢复>25%与此无关。与血小板计数未恢复的患者相比，30天的死亡率有所改善（HR=1.072；95% CI 0.567-2.026；p= .832）。相反，与从第5天到第10天血小板计数增加≥25%的两名患者相比，从第5天到第10天血小板计数持续高的患者的全因死亡率最低（25%对47%；HR2.030；95% CI 1.063–3.877；p= .032）以及从第5天到第10天血小板计数增加 <25%的患者，血小板计数没有改变甚至减少血小板计数（25%对47%；HR2.141；95% CI 1.102–4.157；p= .025）。

讨论

本研究检查了血小板计数和血小板动力学对脓毒症和感染性休克患者的预后影响。该数据表明，血小板<150×10/ml的患者在 30天时的死亡率风险增加，这在多变量Cox回归分析和倾向评分匹配后仍然很明显（表2）。

表2  关于30天的死亡率的单变量和多变量Cox回归分析

在ICU住院期间，血小板计数显示下降21.5%，在第5天达到最低点。特别是，恶性肿瘤、高乳酸水平和入院时低MAP与脓毒症期间血小板计数下降有关。血小板计数下降>25%与30天的死亡率风险增加相关。相反，未发现从第5天到第10 的血小板恢复与30天的死亡率相关。

低血小板计数反映了一种常见的血液学异常，影响了32-55%的ICU患者。由于血小板粘附于白细胞、血管性血友病因子释放增加引起的血小板聚集以及与补体系统相关的血小板破坏，可能会发生血小板减少症。多项针对危重患者的研究调查了血小板减少症在死亡率中的预后作用，表明这些患者的ICU和长期死亡率增加然而，研究队列包括有创伤(40%)和手术并发症(30%)的患者。

值得注意的是，本研究调查了血小板计数在预测感染性休克方面的诊断准确性这是最重要的，因为与未并发休克的脓毒症相比，脓毒性休克与全因死亡率显着增加有关。在本研究中，感染性休克患者的30天死亡率明显更高（65%对42%）。最近，已建立的临床生物标志物（如C反应蛋白和MPV）以及已建立的脓毒症评分（如SOFA和APACHEII评分）显示，用于预测菌血症和脓毒症严重程度的AUC较差至中等各种临床研究。相比之下，本研究将血小板计数确定为感染性休克的可靠预测因子。在这种情况下，血小板计数可能是一种可靠的生物标志物，它易于测量，并且在识别死亡风险最高的患者方面成本更低。

最后，只有少数数据可用于关注脓毒症过程中的血小板计数。塞梅拉罗等人在280名初始血小板减少症（即≤50×109/L）和在脓毒症的前28天内出现血小板减少症的患者中，证明了90天时的死亡率的风险增加。然而，患有中度血小板减少症（即50-100×10/l）的患者不在本研究的范围内。一个大型多中心登记处的40个中心共招募了1449名重症患者，显示出血小板计数的双相模式，在第4天达到最低点。第4天和第14天的血小板减少显示与死亡率的风险增加。然而，这项研究并不局限于因脓毒症入院的患者，48%的患者是在手术或外伤后入院的，6%是在急性冠脉综合征后入院的。本研究与这些发现一致，表明脓毒症第5天达到最低点，而血小板下降的患者与30天的死亡率的风险增加有关。脓毒症过程中血小板的减少，伴随着血小板功能和聚集以及血小板-中性粒细胞聚集的受损，被证明与脓毒症患者的多器官衰竭有关。血小板被证明与不同类型的终末器官衰竭有关。白细胞和血小板的募集可能导致血管内凝血和内皮损伤以及表面活性剂的连续丢失，这有助于证实ARDS的发病机制。结果表明，血小板与感染性并发症有关，例如弥散性血管内凝血(DIC)、感染性心肌病和感染性肾功能衰竭。

专注于血小板恢复在脓毒症或感染性休克过程中的预后作用的数据更少。周等根据“脓毒症3”标准纳入的9709名患者中，表明与非幸存者相比，幸存者血小板计数最低点更高，血小板恢复率更高，持续时间更短。值得注意的是，直到临床改善（定义为停止使用机械通气和停止使用升压药）后才观察到血小板恢复。在本研究中，血小板计数的恢复是从ICU住院的第5天到第10天观察（相应的血小板计数平均增加7.5%）。然而,在本研究中，与血小板计数未恢复的患者相比，血小板计数恢复的患者（定义为从第5天到第10天血小板计数增加>25%）与死亡率改善无关。

总之，血小板计数被证明是诊断脓毒性休克的可靠工具，也是脓毒症和脓毒性休克入院患者30天的死亡率的独立预测指标。 使用多变量Cox回归分析和倾向得分匹配显示一致性。最后，具体而言，ICU住院期间血小板计数下降与30天的死亡率风险增加相关。

 研究限制

这项研究有几个局限性。由于单中心和观察性研究设计，结果可能会受到测量和未测量混杂的影响。进一步的血小板参数，例如MPV和血小板与淋巴细胞的比率(PLR)，不适用于本研究。关于血小板计数的诊断价值，没有考虑健康个体的对照组。最后，本研究没有关于长期死亡率的信息。

述评

在脓毒症中，血小板减少是脓毒症疾病严重程度和死亡率的独立预测指标。在临床上，血小板计数是一种容易获得的血液学参数。脓毒症伴有血小板减少症，血小板减少症的严重程度与死亡率有关。这种血小板减少是弥散性血管内凝血(DIC)的特征，是脓毒症相关的凝血病。许多引起脓毒症的病原体，包括细菌和病毒，也直接激活血小板，这表明病原体诱导血小板激活导致全身性血栓形成并驱动DIC的多器官衰竭。因此，或许可以将血小板减少作为脓毒症患者的“预警系统”。但仍需要进一步的研究来阐明血小板的免疫功能及其具体参与脓毒症的疾病进展的具体机制，以期为更好地开展临床工作提供可靠的指标及指导脓毒症的治疗。综上所述，血小板在脓毒症的发展过程中扮演着重要的角色，参与各种机制来促进免疫反应和凝血激活，对血小板深入的了解将来有可能成为脓毒症新的治疗选择，改善患者的预后，降低病死率。