[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB),俗称结核杆菌(Tubercle bacillus)
非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria,NTM)
Xpert MTB/RIF是通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况,实现MTB核酸和利福平耐药检测的半巢式全自动实时荧光定量核酸扩增技术

结核分枝杆菌

结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB,俗称结核杆菌(Tubercle bacillus),其感染是威胁人类健康的公共卫生问题之一。结核病的早期确诊是患者得到及时救治以及减少MTB传播的重要基础。

实验室检查在结核病确诊中发挥关键作用,尽管针对MTB的实验室检查种类较多又各有所长,但有时依然难以明确诊断。下文就是这样一个肺结核疑似患者的确诊之旅。

案例经过

该患者同时送检了痰抗酸涂片、痰分枝杆菌液体培养以及全血T-SPOT.TB检测。结果如下:

1. 痰涂片未见抗酸杆菌。

2. 痰分枝杆菌液体培养第7天报阳。

阳性培养物在液体培养管(MGIT 960)内呈颗粒状(图1左),符合分枝杆菌的生长特点;阳性培养物的抗酸染色镜检呈现条索状(图1右),提示MTB可能性大。

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断
图 1:患者阳性培养物外观及抗酸染色镜检

为了进一步鉴别阳性培养物里是MTB还是非结核分枝杆菌(Nontuberculosis mycobacteria,NTM),我们使用了结核分枝杆菌抗原检测试剂盒(胶体金法)。该试剂盒可检测MTB生长繁殖过程中所分泌的特异性蛋白质MPB64,用于区分MTB和NTM。该标本两次MTB抗原检测结果均为阴性。

3. T-SPOT.TB检测结果阳性。

ESAT-6(抗原A)85、CEP-10(抗原B)62(参考值:抗原A<6、抗原B<6),提示MTB感染。

综合上述检测结果:阳性培养物的抗酸染色镜检形态以及T-SPOT.TB检测结果均提示MTB感染,但MTB抗原检测却是阴性。面对这种多项检测结果不一致的情况,我们是否可以根据抗原检测结果判读为NTM,还是要做进一步检测?

编者附注:这里再安利下T-SPOT.TB检测


一、T-SPOT检测的机理是什么?

人体对结核分枝杆菌的免疫反应主要通过T细胞活化介导。对结核分枝杆菌致敏的T细胞,再次接受结核相关抗原刺激后,活化的效应T细胞(包括 CD4+和 CD8+T 细胞)能够产生γ干扰素,通过ELISPOT 技术可以检测产生γ干扰素的单个T细胞。ELISPOT检测是高灵敏度的,在细胞分泌的细胞因子扩散稀释前,其能够立即捕获细胞周围所分泌的细胞因子,灵敏度超过传统的酶联免疫吸附剂测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)。

T-SPOT检测用来刺激T细胞的是结核分枝杆菌特异性抗原→ESAT-6和CFP10抗原,这两个抗原在BCG菌株和绝大部分非结核分枝杆菌(除外堪萨斯分枝杆菌、苏氏分枝杆菌、海分枝杆菌)中都不存在,因此有较高的特异性,跟卡介苗和绝大部分的肺结核分支杆菌无交叉反应。

所以,T-SPOT检测通过ELISPOT技术和特异性抗原,从原理上保证了其一定的敏感性及特异性。

二、为什么说T-SPOT检测既完美又不完美?

然而,T-SPOT检测结果却不能作为单独或是决定性的诊断活动性结核病的依据。

T-SPOT阳性结果仅仅提示患者体内存在结核杆菌特异的效应T细胞:即患者存在结核感染或者有可能是堪萨斯、苏氏、戈登或海分枝杆菌等少数几种非结核分枝杆菌感染引起的。但是否为活动性结核病,需结合临床症状及其它检测指标综合判断。

结核感染通常表现为显性感染和潜伏性感染。显性感染即活动性肺结核,在大多数传染病中,显性感染只占全部受感染者的一小部分。潜伏性感染又称潜在性感染,病原体感染人体后,寄生于某些部位,由于机体免疫功能足以将病原体局限化而不引起显性感染,但又不足以将病原体清除时,病原体便可长期潜伏起来,待机体免疫功能下降时,则可引起显性感染,潜伏感染期间,病原体一般不排除体外。

结核潜伏性感染(Latent Tuberculosis Infection, LTBI)具有发展为活动性结核病的风险。活动性结核与LTBI是结核分枝杆菌感染的不同阶段,IGRA检测的结核分枝杆菌特异性效应T细胞经特异性抗原刺激后释放的γ干扰素,在活动性结核与潜伏结核感染(LTBI)中均有释放。多项研究结果显示IGRA都只能判断是否感染结核,但无法鉴别活动性结核与结核潜伏性感染。

因此,T-SPOT—IGRA对活动性结核病的诊断价值有限。


案例分析

我们首先通过查阅资料,发现MTB抗原检测(胶体金法)在以下情况中会出现假阴性:1.样本中MPB64浓度低于试剂盒检出限;2.牛分枝杆菌(M.bovis) BCG的几种亚株不产生MPB64蛋白;3.MPB64编码基因突变[1]。这虽能对MTB抗原检测阴性的结果做出解释,但依然不能确定阳性培养物菌体是否为MTB。还能再增加什么检测项目做进一步确认呢?

最后,我们建议该患者增加MTB核酸检测——Xpert MTB/RIF检测,阳性培养物和患者痰液样本结果显示为阳性(图 2)。

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断
图 2:患者痰液样本的Xpert MTB/RIF 检测结果

这与临床同份痰液样本的二代测序(mNGS)结果(图 3)一致,检出结核分枝杆菌复合群的核酸序列而未检出NTM的核酸序列。结合患者的临床表现和影像学检查结果,最终该患者被诊断为结核病。

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断
图3: 患者同份样本的二代测序结果

什么是Xpert MTB/RIF检测?

Xpert MTB/RIF是通过检测MTB基因组中的rpoB基因及其突变情况,实现MTB核酸和利福平耐药检测的半巢式全自动实时荧光定量核酸扩增技术。

该技术具有以下优势:

特异性好

特异性近100%[2],能准确区分MTB和NTM。

灵敏度高

敏感性约53.54%[2],比涂片法和培养法更敏感。

检测快速

完成检测仅需2小时。相比液体培养法耗时3~45天以及mNGS耗时约30小时,能有效缩短检测时间。

适用广泛

痰液、肺泡灌洗液、肺组织、脑脊液、淋巴结、关节液以及尿液等均可用于检测。

同时检测利福平耐药

检测对一线抗结核药物利福平的耐药情况,敏感性约97.6%,特异性约98.1%[3],可及时为临床用药提供有效参考。

MTB核酸检测助力结核病诊断

病原微生物学检测是确诊结核病的重要依据,传统的病原微生物学检测包括涂片法和培养法。涂片法价格低廉、操作简单,但敏感性差;培养法是结核病诊断的金标准,但由于检测周期过长,不能为临床提供有时效性的检测结果。而MTB核酸检测作为一种分子生物学技术,能够在一定程度上弥补传统检测方法的不足。

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断 [病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断

 

随着分子生物学的发展,核酸检测技术在病原学诊断和耐药性检测中应用广泛。Xpert MTB/RIF在检测MTB感染中具有精准快速的突出优势,能够为临床医生诊疗结核病提供强有力的支持。

【参考文献】

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断

 

附录

[病例交流] Xpert MTB/RIF 实现结核分枝杆菌的鉴别诊断

本文荟萃自公众号:沈佳瑾 周春妹 检验医学网,只做学术交流学习使用,不做为临床指导,本文观点不代表数字重症立场。